• 百岁人瑞的秘密-克菲尔益生菌AB Kefir的应用
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  • The Secret Of Longevity-Application of kefir probiotic
    时间：2015-08 来源：亚洲食品与饮料 • 专刊2015 NEW MATERIAL 新原料
    作者：张忆如 （生合生物科技集团产品开发主任 ,台湾高雄）
    摘要：肠道是人体营养吸收和代谢产物排泄的主要功能场所，更是机体中最大的免疫器官。随着饮食西方化、工作压力与生活型态的改变，易出现腹痛、腹泻、排便不顺等肠道老化的困扰，衍生出脸色不佳与容易生病的问题。根据调查，有上述肠道困扰的网友比例高达九成五，证明肠道困扰问题已经存在已久。
         二十世纪初诺贝尔奖得主，前苏联科学家梅契尼可夫发现高加索的居民长年大量饮用一种叫克菲尔的酸奶，因含有丰富的益生菌，抑制肠道腐败菌，减少肠道老化，是全村平均年龄超过一百岁的长寿重要因子之一。因此，摄取好菌、防止肠道老化与长寿有着密不可分的关系。在克菲尔的丰富菌相中，选出七株具有共生发酵特性的乳酸菌株-AB克菲尔，具有耐胃酸、胆盐与吸附肠道等能力，贮存稳定，有优良的发酵特性。然后，以一般健康的年轻人进行测试发现，每天摄取100亿的AB克菲尔乳酸菌，持续三周，可以明显缩短便秘日数、改善便秘程度、解决排便时腹胀、腹痛与腹泻等肠道困扰(P<0.05)。克菲尔发酵乳适用于酸奶发酵剂与保健品的使用，能给人们提供更简单的肠道保健方式。
    关键词：克菲尔、长寿、乳酸菌、发酵剂、肠道保健 
    Abstract：The human intestine is not just the main place for nutrition digestion and absorbtion, but also the the body’s largest immune organ. With the westernization in diet, work-stress and different lifestyle, people are easy to have abdominal pain, diarrhea, and other intestinal problems, which may lead to have sick face and get cold easily. According to an online survey, 95% of people suffered from intestinal problems, and showed that these problems have been existed for a long time. The Nobel laureate, former Soviet scientists, Elie Metchnikoff was intrigued as to why certain inhabitants of the Caucasus Mountains lived much longer than others. Discovering that the villagers were drinking a fermented milk drink called “kefir” on a daily basis, his studies found the bacteria in the kefir improved their health and may have helped the longevity of their lives. AB-Kefir, a defined mutistrain starter culture, were selected from traditional kefir grain and manufactured by state of the art technology, and showed good probiotic characteristics, just like tolerance to acid and bile salt, and excellent adherence to intestinal cell. In a human trial, healthy volunteers were included and AB-kefir(containing 1010CFU/g) was taken daily for 3 weeks. The duration and condition of constipation, excrement appearance, bloating, abdominal pain, diarrhea and other intestinal problems were improved(P<0.05). Therefore, AB-Kefir can be used as a starter culture or a diet supplement, and provide the easy way for taking care of intestinal health.
    Keywords： Kefir、longevity、lactic acid bacteria、culture starter、intestine care
    前言：
           克菲尔(Kefir)是一种历史悠久的发酵乳，源自1300年的北高加索山区，是当地居民平日习惯的饮料。而高加索居民正是世界著名的长寿村之一，“Kefir”相传是源于土耳其语“Keyif”，意指「feeling good」，用来描述食用这种发酵乳所感受的美妙经验。因当地居民平均年龄为一百岁，普遍长寿的现象引起前苏联科学家梅契尼可夫关注，通过仔细观察这群居民作息，发现了高加索山居民长寿的秘密就是平日习惯饮用克菲尔。
            克菲尔发酵乳为克菲尔粒(Kefir grains)发酵牛奶的产物，不同于一般单株或较少数菌株发酵的发酵乳，克菲尔粒由不同的乳酸菌、酵母菌等菌株，发酵牛奶产生的多醣体与蛋白质基质组合成粒（Farnworth and Mainville, 2008），彼此菌株形成共生关系，经过共生菌株的代谢与协同生长，使牛奶变成拥有多元且丰富代谢产物的发酵乳。因为它富含维生素、氨基酸、有机酸、双乙酰(diacetyl)与乙醛(acetaldehyde)等因子，既是克菲尔发酵乳高营养与独特风味的来源，也是抑制肠道害菌生长的因子，许多研究指出， 克菲尔发酵乳具有多重益生作用，例如调节肠道菌相、免疫调节、预防癌症以及降胆固醇。
            随着社会文明的发展，饮食习惯西方化、工作压力大与生活节奏紧凑，人们很容易有不同程度的肠道老化现象，有碍于健康的发展。根据2012年的调查，国人有9成以上有肠道困扰，分别是便秘、腹胀、腹泻、食欲不振、肤况欠佳以及免疫力低下等症状，普遍的肠道困扰严重影响到国人健康与生活质量。而民间制造克菲尔虽然简易，但容易因操作失当而造成杂菌污染，并且每经一次发酵，克菲尔粒的菌相组成就受发酵时间、温度等发酵条件的影响，产生变异，因而使用克菲尔粒作为工作发酵剂，难以保证发酵乳制品风味及质量性能的批次稳定性，不易应用于工业化生产。因此，我们从克菲尔粒中挑选出占比较高的共生乳酸菌，共7 株，进行细菌作为肠道益生菌标准的要求检测-耐酸、耐胆盐与肠道吸附，组合成改善肠道健康潜力的菌株，以专业的共生发酵工程固定化的成品-AB克菲尔，配合医学院的人体试验，观察每日食用后对减缓肠道困扰症状减缓效果， 确认其对肠道保健的功能性。   


    材料与方法:
            1.乳酸菌:从克菲尔粒筛选之嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(L.paracasei )、发酵乳杆菌(L.fermentum)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、鼠李醣杆菌(L. rhamnosus)
    与长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)等七株乳酸菌，并以SYNTEK® thorough制造技术，共生发酵，并且将其代谢产物与菌体收集，以优质冷冻干燥技术生产菌粉，命名为AB克菲尔，每克菌数达300亿以上。
            2.消化道耐受性
    参考Cukrowaka等人于2009发表的方法并修饰之，模拟菌株进入消化道环境后，测试胃与肠道的存活性。
    耐胃酸测试：
    将AB克菲尔菌粉置于0.85%且调整为pH3.0的氯化钠溶液，于37度环境下以100rpm震荡虐待2小时，并于0、1、2 小时取1ml，测定存活菌数。
    耐胆盐测试：
    将AB克菲尔菌粉置于含有0.3%胆盐的乳酸菌液态培养基(MRS)中，于37度环境下培养16小时，测试0与16小时的菌数，观察衰退情形。
     3.肠细胞吸附性：
     


           参考Greene and Klaenhammer（1994）之方法，简述之。使用人类肠道细胞株Caco-2。将细胞株于液态氮保存，冷冻保存管经37℃水浴快速回温后，倒入角型培养皿后，添加10ml含10%FBS(Fetal bovine serum)、50 unit/mL penicillin 及100ug sterptomycin之αMEM细胞培养基，以37℃、5%CO2气体培养之， 细胞经数次继代及生长稳定后，进行吸附试验。
           将细胞以104cells/well分置24孔细胞培养盘中，以37℃、5%CO2气体培养Caco-2细胞连续14天，将AB克菲尔以无菌PBS稀释至1x108CFU/ml，
           以37℃、5%CO2气体培养2小时，去除培养液，并以P B S清洗未吸附之乳酸菌，以革兰氏染色与显微镜观察之，并拍照。
    4.贮存试验：
           以King学者(1998)提出的快速虐待四周等同室温下一年的检测平台， 将3 00亿菌粉以铝箔袋包装后，放置37℃下虐待4周，每周取1包检测菌数，并观察其衰退情形。
           5.发酵特性测试与风味品评：  11 . 5%全脂奶粉+ 6 %砂糖，以95℃杀菌15min。每吨接菌量100U并于43℃进行发酵，每小时测定pH值与酸度，观察其发酵曲线，并且达发酵乳pH值达4.5以下时，进行口感测定。
           6 .以生合集团的克菲尔益生菌AB-Kefir菌粉做成固体饮料，进行人体临床试验：
          与台湾台南成功大学医学院合作，搜集肠道困扰的受试者共27位， 先经由问卷确认受试者肠道困扰症状与程度，包含便秘日数、程度、排便情形、腹痛、腹泻等，给予受试者每天食用克菲尔颗粒产品(菌数100亿/包)两次，每周以问卷调查改善情况，试验维持三周。   


    结果与讨论：
         乳酸菌经过摄取之后，必须存在足够菌量改善肠道环境，但从食道进入到消化道过程，对菌株最大的挑战就是低pH值的胃酸与肠道前段的胆盐水解作用，乳酸菌多半因此受到破坏或死亡。作为益生菌，首要存活条件必须能通过耐受消化道环境。图1与图2为AB克菲尔通过肠胃道的能力，如结果所示，引起活菌数下降的情况并不明显。从图1数据显示，在胃酸达pH3.0的环境，并未使AB克菲尔的菌数大幅下降，经过2小时低pH的虐待，存活的菌数均达1010CFU/mL以上。此外，在含有0.3%胆盐的环境也未见有减弱的现象(图2)。
     
    图1. AB克菲尔耐胃酸能力的评估
     
            
    图2. AB克菲尔耐胆盐能力的评估 
          乳酸菌的菌粉，无论作为工业化的工作发酵剂还是保健品应用原料， 贮存稳定性是非常重要的考虑因素。益生菌产品的稳定性不仅指的是菌株本身的存活率，也包括会使菌株代谢与功能性效果产生变化的情况。若产品在货架期间(shelf-life)衰退太多， 可能减弱益生菌株原本可发挥的健康效益(Miguel and Sánchez, 2012)。由图3显示，AB克菲尔经由SYNTEK® thorough制造技术作为菌粉的贮存稳定性，经过快速虐待平台显示，维持四周37℃的虐待，菌数衰退并不明显，并且活菌数维持1010CFU/g以上，显示出优异的贮存耐受性，表示AB克菲尔以室温下贮放一年菌数稳定的现象。此外，益生菌株必须对肠道细胞具吸附能力，可避免因肠道蠕动而被排出体外，具有吸附能力之乳酸菌，可阻碍许多致病性与非致病性的细菌吸附， 侵入宿主肠道细胞；图4表现出AB克菲尔菌株对人类肠细胞株Caco-2吸附优异的情况，因属共生发酵之菌株，有杆菌、球菌等七株菌，显微镜观察菌体的外观也比较多元，明显可吸附于Caco-2表面上。 
    图3. AB克菲尔贮存稳定性的评估


     
           图4. 显微镜下观察AB克菲尔吸附人类肠细胞株之情形
     
        AB克菲尔的发酵特性，如图5所示， 以11.5%全脂奶粉+6%砂糖，杀菌后，每吨接菌量100U并于43℃进行发酵，发酵8小时，酸度>70oT，pH≤4.80。另外，风味品评，发现AB克菲尔发酵剂所制之发酵乳，其黏度低，口感丰富，后增酸弱，适合用于饮用型或稀释发酵乳的生产。
     
    图5. AB克菲尔发酵还原乳的发酵曲线
     
       学者Yang等人研究指出，有便秘困扰的中国女性每日摄取含B.lactis DN-173010的发酵乳，分别在第一周与第二周改善便秘百分比分别为40% 与58%，而Gerritsen等人于2011年表示摄取益生菌可帮助肠道的菌相平衡， 促进肠道蠕动，而改善了便秘的情况。本试验初期，在27位有肠道困扰的受试者中发现，有约75%的人有轻微便秘的现象，表示便秘情形相当普遍。从图6、图7结果表示，在每日摄取两次AB克菲尔颗粒产品后，随着摄取天数增加， 改善受试者的便秘程度与日数日益显著(P<0.05)。



    图6.每日摄取两包AB克菲尔颗粒产品改善便秘日数的情况
     


    图7.每日摄取两包AB克菲尔颗粒产品改善便秘日数的情况
     
          正常的排便，是没有疼痛感与其他不适的，但粪便坚硬或呈现颗粒状时，常引起排便不顺、疼痛或出血等症状。De Paula等人研究指出，饮品功能性含共生发酵的发酵乳，可明显降低排便时的疼痛感。图8指出，AB克菲尔可明显改善粪便坚硬或颗粒便的现象。
     
    图8.每日摄取两包AB克菲尔颗粒产品改善排便形状的情况


           欧美或者其他发展较先进的国家，对于肠胃疾病都建议使用益生菌做初期保健或减缓症状的应用。许多研究指出，益生菌对肠躁症、便秘、腹痛、腹泻、胀气等肠道后段容易发生的问题有改善效果;此外，也有学者认为，复合益生菌对抗生素引起的腹泻有明显改善的效果。肠胃腹痛或腹泻的原因， 有些是因为肠道气体的关系，而益生菌亦可帮助排气，但有些研究也发现有些菌株对于改善腹痛、腹泻并没有显着影响，故并非所有的益生菌都有调整肠胃的功能。AB克菲尔颗粒乳酸菌改善受试者腹痛与腹泻之结果，分别如图9与图10，每日摄取AB克菲尔显著改善腹痛与腹泻之症状。
     
    图9.每日摄取两包AB克菲尔颗粒产品改善腹痛的情况
     
           


    图10.每日摄取两包AB克菲尔颗粒产品改善 
    总结：
           肠道对人体来说，扮演着非常重要的角色。作为消化吸收器官，也是机体最大的免疫器官，因生活型态的改变， 有着肠道困扰的人数也日益增加。克菲尔拥有百年悠久的食用历史，许多研究相继也证实了对肠道的好处，从本文中试验结果显示，从克菲尔粒筛选出来的七株共生乳酸菌-AB克菲尔，可通过肠道耐受性与吸附肠道上皮细胞的特性，且具有优良的发酵特性与口感风味，对普遍常见的肠道困扰有明显改善的效果，是作为工业发酵剂与肠道保健品的绝佳选择。