• 抗敏新素材-植生型益生菌酸奶发酵剂
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  • 时间：2016-05-20 来源：台湾生合
     


    摘要：
          过敏性疾病是一种与环境、遗传有关的慢性发炎反应，在儿童与青少年时期最常见的慢性疾病，且在先进国家的过敏人数发现比例有较高的趋势。从研究指出，某些益生菌用于过敏性疾病的初级预防效果得到肯定，被认为除肠胃道保健外的另外一个最大的保健应用性。益生菌(probiotic)是泛指存在于宿主中活的微生物或者是微生物的成分，且对其宿主是有益的，经由肠道的菌相刺激免疫细胞，产生免疫调节或减缓过敏的帮助。本研究的目的为筛选出具有减缓过敏潜力的乳酸菌株，以人类周围血液单核球 (human peripheral blood mononuclear cells;hPBMC)与潜力菌株共培养后，使用酵素免疫法测定其分泌Th1细胞激素-干扰素-γ与Th2细胞激素介白素4等浓度，评估乳酸菌对免疫细胞的调节能力。结果显示，从200株乳酸菌筛选出6株刺激PBMC产生较高的干扰素-γ浓度。六株乳酸菌当中以台湾豆干来源之植物乳杆菌LP28，从干扰素-γ与介白素4的比值，显示LP28可调节免疫反应走向Th1的能力，高于其他市售减敏菌株3倍之多，不仅具备了耐酸、耐胆盐、吸附力与贮存稳定性的特性，更可作为发酵豆奶、牛奶的工作发酵剂，使应用性变得更广阔。因此，植物乳杆菌LP28可做为减缓过敏之益生菌使用，可应用于功能性酸奶或减敏保健品之应用。
     
    关键词: 
    益生菌、乳酸菌、过敏、细胞激素、干扰素-γ、介白素4
     
    引言:
          长久以来，乳酸菌在发酵食物中广泛被使用已是很普遍的事实，而且大家认为发酵奶类制品可使人类更健康、与长寿，甚至可用于治疗临床疾病，因此将活菌加入每日的像是发酵乳等食品中或制成胶囊、锭剂、粉末等剂型，供人类方便使用；这就是现在益生菌的观念(Lee and Lin, 2005)。早在1965年，Lilly 与Stillwell提出益生菌(probiotic)这名词，此字是源自希腊文，其意思为“for life” ，而Fuller(1989)将益生菌定义为「凡能改善宿主肠道内的菌相达到互相平衡，而有益于影响宿主的活微生物的补给物」。到目前为止，益生菌对人体的临床健康帮助，包含了治疗腹泻、乳糖不耐症、食物过敏、异位性皮肤炎、发炎性肠道疾病与改善免疫力等，在过敏方面，也有学者提出利用益生菌来预防食物过敏或减轻过敏的症状。
          从过敏性疾病的发生观点来分析，正常人的免疫反应可大分为两种分别由不同的帮助型 T 细胞所负责。通常正常的免疫反应主要是由第一型帮助型 T 细胞所负责(Th1) 而过敏的免疫反应则由第二型帮助型 T 细胞负责 (Th2）。对于过敏体质遗传不明显的新生儿而言，他们的免疫反应于出生之后有机会很快的转移到偏向第一型帮助型T细胞（Th1）的正常免疫反应，但是仍然有少部分的新生儿会持续进行过敏的Th2反应，甚至产生临床过敏症状(徐, 2008)。
          研究指出，一般发现在过敏的儿童肠胃道菌落中，Lactobacillus 和Bifidobacterium 之生成有延迟的现象(Adolfssonet al., 2004)。而怀孕妇女自生产前4周服用乳酸菌LGG，婴儿出生后继续给予6 个月的LGG，发现能明显减少高危险群婴儿早期之过敏性疾病(Kalliomakietal., 2001)。Kirjavainen等学者于2003的研究，LGG加入牛奶配方式是否减缓新生儿过敏情况，结果显示，一组牛奶配方中加入活的LGG ，另一组则用已经过加热处理的牛奶配方给异位性皮肤炎及牛奶蛋白过敏的新生儿，结果发现LGG一组效果较好，且热处理过之牛奶配方也仍会造成过敏。诸如此类的研究认为，益生菌被可能会使肠黏膜通透性增加现象改善、让肠道内IgA 的反应增强、促进IL-10 及TGF-β产生、重建肠内菌落使其恢复正常，进而促进肠障蔽功能、促进干扰素-γ (interferon-γ,Th1细胞激素)的产生以抑制由介白素4 ( interlukin-4,IL-4,Th2细胞激素)诱导出IgE的生成作用。故本次研究从天然来源之200株乳酸菌，个别与人类周围血液单核球共培养做为平台，以干扰素-γ与介白素4作为指标，先筛选出潜力菌株，再与商业减敏菌株做比较，筛选出具有减缓过敏的菌株，且进行耐酸胆盐、肠道吸附性与贮存性的测试。
     
    材料与方法：
          免疫调节能力
          从搜集天然界各种乳酸菌的生合菌种库中的200株之乳酸菌。经过乳酸菌培养基MRS broth以37℃培养16小时活化，如此反复活化三次后，取1mL 培养基，经过3000rpm离心10分钟，去除上清液，加入无菌的PBS加以清洗，如此反复3次，取得菌体，并以PBS覆溶至1mL，分别将菌数调整为106、107、108 CFU/mL。
          抽取志愿者静脉血10mL，并以肝素抗凝血。以Hank’s溶液稀释之，用Ficoll溶液进行梯度离心，获得PBMC，经过洗涤后，以RPMI-1640将PBBMC的浓度调整为1x105 cells/mL，并以八爪分注器，将细胞分至96孔培养盘(Gibco)，各菌株均3重复，每孔中含有180 uL细胞液与20 uL乳酸菌悬浮液，以37℃、5 % CO2 培养48小时，取出上清液，以ELISA Kit检测干扰素-γ，并选出刺激PBMC分泌较高干扰素-γ的前六名之菌株。再与其他市售减敏菌株-LP33与LGG，进行干扰素-γ与介白素-4的比较。
     
    消化道耐受性
          参考Cukrowaka等人于2009发表的方法并修饰之，模拟菌株进入消化道环境后，测试胃与肠道的存活性。
          耐胃酸与耐胆盐测试，简述如下。将菌体置于0.85%且调整为pH3.0的氯化钠溶液，于37度环境下以100rpm震荡虐待2小时，并于0、1、2小时取1 ml，测定在低pH环境下其存活菌数。含有0.3%胆盐的乳酸菌液态培养基(MRS)中，于37度环境下培养16小时，观察衰退情形，并且同时与市售减敏菌株做比较。
     
    肠细胞吸附性
         参考Greene andKlaenhammer(1994)之方法，简述之。使用人类肠道细胞株Caco-2。将细胞株于液态氮保存，冷冻保存管经37℃水浴快速回温后，倒入角型培养皿后，添加10ml 含10 % FBS(Fetal bovine serum)、50 unit/mL penicillin及100 ugsterptomycin之 αMEM细胞培养基，以37℃、5 % CO2气体培养之，细胞经数次继代及生长稳定后，进行吸附试验。
    将细胞以104 cells/well分置24孔细胞培养盘中，以37℃、5% CO2气体培养Caco-2细胞连续14天，将LP28以无菌PBS稀释至1x108CFU/ml，以37℃、5% CO2气体培养2小时，去除培养液，并以PBS清洗未吸附之乳酸菌，以革兰氏染色与显微镜观察之，并拍照。
     
    贮存试验
          以King学者(1998)提出的快速虐待四周等同室温下一年的检测平台，将LP28菌粉经由生合独创的SYNTEK®thorough菌粉优化制造技术生产菌粉，菌数可达1011 CFU/g，并以铝箔袋包装后，放置37℃下虐待4周，每周取1包检测菌数，并观察其衰退情形。
     
    结果与讨论:
          图1为从200株菌株中，筛选出前六株刺激干扰素-γ较高的乳酸菌株。PMBC分泌干扰素-γ的浓度随菌数提高而增加的趋势，从106与107的的结果指出，编号为080003之乳酸菌，是源自台湾大溪传统豆干的乳酸菌，其可刺激PBMC分泌较高量的干扰素-γ，经过鉴定后，确认其为Lactobacillus plantarum，命名为LP28。并且与市售的减敏乳酸菌相较下，LP28的干扰素-γ与介白素-4的比值，高于其他两株乳酸菌，表示LP28更能将导向Th1的免疫反应(如图2)。
     


    图1.六株乳酸菌刺激PBMC产生干扰素-γ
     





    图2. LP28与其他两株市售减敏乳酸菌比较免疫调节能力
     
          胃酸与胆盐具有抗菌作用，乳酸杆菌首先必须面对恶劣的胃酸，同时要抵抗胆盐，但乳酸菌要发挥作用，必须存在足够菌量改善肠道环境，但从食道进入到消化道过程，对菌株最大的挑战就是低pH值的胃酸与肠道前段的胆盐水解作用，乳酸菌多半因此受到破坏或死亡，故耐酸耐胆盐特性是乳酸杆菌作为功能性添加剂的重要指标之一。图3、图4分别为LP28与市售减敏菌株耐酸胆盐之比较，结果显示LP28与LGG有较佳的耐酸与耐胆盐表现。



    图3. LP28与市售碱敏乳酸菌耐酸能力之比较
     
     


    图4. LP28与市售碱敏乳酸菌耐胆盐能力之比较
     
          肠道为动物最大的免疫器官，肠道内层中有许多的淋巴结与淋巴细胞，攸关着宿主整个免疫调节，肠道的微生物更因此与宿主存在着共生的关系，肠道菌通常经由吸附到肠道细胞后，进入肠道内层产生一连串的免疫反应，故益生菌株是否具有吸附肠道上皮细胞的能力，对其发挥调节免疫力是非常重要的机制。图5显示，LP28吸附人类肠道上皮细胞株表现优异。

     

    图5.植物乳杆菌LP28对人类肠道上皮细胞株吸附之情形
     
          乳酸菌的菌粉，无论作为工业化的工作发酵剂或是保健品应用原料，贮存稳定性是非常重要的考虑，益生菌产品的稳定性不仅指得是菌株本身的存活率，也包括会使菌株代谢与功能性的效果产生变化，若产品在货架期间(shelf-life)衰退太多，可能减弱益生菌株原本可发挥的健康效益 (Miguel and Sánchez, 2012)。图6表示出LP28经过经过SYNTEK®thorough所生产之菌粉，以快速虐待平台的检测，菌数并没有显着的衰退现象，意指LP28菌粉在室温下贮存一年以上，并且菌数不低于1011 CFU/g，有别于一般需冷链运输与贮藏的市售减敏益生菌。


     



    图6.植物乳杆菌LP28贮存稳定性的表现
    总结:
          LP28可调节免疫反应走向Th1的能力，高于其他市售减敏菌株3倍之多，不仅具备了耐酸、耐胆盐、吸附力与贮存稳定性的特性，更可作为发酵豆奶、牛奶的工作发酵剂，使应用性变得更广阔。因此，植物乳杆菌LP28可做为减缓过敏之益生菌使用，可应用于功能性酸奶或减敏保健品之应用。